![\"Large_2014_10_08.jpg\"](\"\/wp-content\/uploads\/201408\/Large_2014_10_08.jpg\" "\\"Large_2014_10_08.jpg\\"")
\nEn 1873, un physicien allemand \u00e9nonce une barri\u00e8re absolue \u00e0 la microscopie: la limite de diffraction, due \u00e0 la nature ondulatoire de la lumi\u00e8re. Ernst Abbe montre qu\u2019on ne peut fabriquer un microscope optique avec une r\u00e9solution inf\u00e9rieure \u00e0 la moiti\u00e9 de la longueur d\u2019onde de la lumi\u00e8re utilis\u00e9e. Impossible de distinguer deux points s\u00e9par\u00e9s par moins de 200 nm (ou 0,0002 mm).<\/p>\n
Cent vingt ans plus tard, le physicien allemand Stefan Hell d\u00e9passe cette limite avec l\u2019invention de la technologie STED (pour \u00abStimulated Emission Depletion Microscopy\u00bb). Cette avanc\u00e9e lance le domaine de la super-r\u00e9solution, qui aujourd\u2019hui permet d\u2019atteindre une pr\u00e9cision dix fois plus grande: 20 nm, soit la taille d\u2019un petit virus ou d\u2019une membrane cellulaire mince.<\/p>\n
Franchir les limites de diffraction<\/strong><\/p>\n L\u2019invention s\u2019av\u00e8re capitale pour la biologie et la m\u00e9decine, o\u00f9 la microscopie optique joue un r\u00f4le central, notamment parce que la lumi\u00e8re ne d\u00e9truit pas les \u00e9chantillons sensibles et permet de les \u00e9tudier vivants. D\u2019autres techniques (les microscopes \u00e9lectroniques, \u00e0 effet tunnel ou \u00e0 force atomiques) permettent d\u2019obtenir des images d\u2019objets bien plus petits, mais ils ne permettent pas de travailler avec des cellules vivantes, car ils n\u00e9cessitent la pr\u00e9paration de coupe ou la mise sous vide.<\/p>\n Les chercheurs des sciences biom\u00e9dicales doivent pouvoir observer pr\u00e9cis\u00e9ment des cellules vivantes enti\u00e8res afin de pouvoir d\u00e9celer les d\u00e9tails qui pourraient se r\u00e9v\u00e9ler d\u00e9terminants, comme par exemple pour comprendre les processus cellulaires \u00e0 la base de la m\u00e9moire.<\/p>\n Le neurobiologiste Valentin N\u00e4gerl de l\u2019Universit\u00e9 de Bordeaux \u00e9tudie le r\u00f4le de la nano-anatomie des synapses dans le traitement de l\u2019information, et doit observer des structures de moins de 100 nm. \u00abNous avons r\u00e9ussi \u00e0 d\u00e9montrer qu\u2019un stimulus d\u2019apprentissage \u00e9largit le petit canal qui relie l\u2019\u00e9pine dendritique post-synaptique au reste de la cellule, explique le chercheur. C\u2019est la microscopie STED qui a rendu cette observation possible. Pour nous, elle repr\u00e9sente un v\u00e9ritable saut quantique.\u00bb<\/p>\n Pour d\u00e9passer la limite de diffraction, Stefan Hell s\u2019est appuy\u00e9 sur la microscopie \u00e0 fluorescence. Dans cette technique, le microscope n\u2019observe pas directement les objets eux-m\u00eames, mais des mol\u00e9cules fluorescentes qui s\u2019y sont coll\u00e9es. Une fois excit\u00e9es par l\u2019illumination d\u2019un laser d\u2019une longueur d\u2019onde bien d\u00e9finie, ces mol\u00e9cules \u00e9mettent une lumi\u00e8re fluorescente per\u00e7ue par le microscope.<\/p>\n Mais la technique souffre elle aussi d\u2019un probl\u00e8me de r\u00e9solution: des d\u00e9tails similaires marqu\u00e9s par les m\u00eames mol\u00e9cules fluorescentes ne peuvent \u00eatre distingu\u00e9s lorsqu\u2019ils sont tr\u00e8s proches les uns des autres, car les lumi\u00e8res qu\u2019ils \u00e9mettent se chevauchent et ne peuvent \u00eatre s\u00e9par\u00e9es par les d\u00e9tecteurs.<\/p>\n Faire clignoter les mol\u00e9cules<\/strong><\/p>\n Le chercheur a d\u00e9cid\u00e9 d\u2019illuminer les diff\u00e9rentes mol\u00e9cules tour \u00e0 tour, afin de distinguer des d\u00e9tails identiques tr\u00e8s proches. Son astuce consiste \u00e0 envoyer un deuxi\u00e8me faisceau laser ayant une section en forme d\u2019anneau qui \u00e9teint les mol\u00e9cules illumin\u00e9es par le premier laser, qui est bien plus large (d\u2019o\u00f9 le nom de la technique: d\u00e9pl\u00e9tion par \u00e9mission stimul\u00e9e).<\/p>\n Ainsi, seules les mol\u00e9cules au centre de l\u2019anneau \u2014 dont la taille peut \u00eatre r\u00e9duite presque \u00e0 l\u2019envi \u2014 \u00e9mettent de la lumi\u00e8re par fluorescence et sont per\u00e7ues par le microscope. \u00abLe pouvoir de r\u00e9solution du microscope ne d\u00e9pend plus de la focalisation de la lumi\u00e8re mais plut\u00f4t des propri\u00e9t\u00e9s des mol\u00e9cules\u00bb, d\u00e9clare Stefan Hell. En combinant chimie et optique, elle cr\u00e9e une alternance de clair-obscur qui permet de repousser les limites de la microscopie.<\/p>\n Du hasard pour plus de d\u00e9tails<\/strong><\/p>\n En 2006, deux nouvelles m\u00e9thodes apparaissent: PALM et STORM. Elles se basent \u00e9galement sur le principe du \u00abclair-obscur\u00bb, mais utilisent pour cela des mol\u00e9cules fluorescentes particuli\u00e8res. Celles-ci doivent d\u2019abord \u00eatre activ\u00e9es une premi\u00e8re fois par une impulsion lumineuse, avant que le processus de fluorescence puisse \u00eatre enclench\u00e9 par un second laser.<\/p>\n Comme cette activation est limit\u00e9e dans le temps et se produit de mani\u00e8re al\u00e9atoire, seules quelques mol\u00e9cules \u2014 le plus souvent \u00e9loign\u00e9es l\u2019une de l\u2019autre \u2014 contribuent \u00e0 chaque image par fluorescence. La vue d\u2019ensemble de l\u2019\u00e9chantillon comprenant toutes les mol\u00e9cules tr\u00e8s proches l\u2019une de l\u2019autre est obtenue en superposant des milliers d\u2019images enregistr\u00e9es successivement.<\/p>\n \u00abCette technique est largement ancr\u00e9e et meilleur march\u00e9 que STED, car elle est moins exigeante sur le plan optique, explique Thomas Misgeld, professeur \u00e0 l\u2019Institut de biologie cellulaire du syst\u00e8me nerveux \u00e0 la Technische Universit\u00e4t M\u00fcnchen. Elle pr\u00e9sente cependant l\u2019inconv\u00e9nient de fonctionner par superposition d\u2019images, ce qui peut \u00eatre g\u00eanant pour les objets vivants.\u00bb<\/p>\n De plus, toutes ces m\u00e9thodes pr\u00e9sentent le m\u00eame d\u00e9faut: elles ne permettent pas d\u2019obtenir des d\u00e9tails dans les profondeurs des tissus. Or, c\u2019est pr\u00e9cis\u00e9ment ce que souhaitent des chercheurs comme Thomas Misgeld, qui \u00e9tudie les l\u00e9sions des nerfs de la moelle \u00e9pini\u00e8re lors de blessure ou d\u2019une scl\u00e9rose en plaques, qui peuvent conduire \u00e0 la paralysie. Il doit pouvoir visualiser les structures telles que les mitochondries, situ\u00e9es \u00e0 l\u2019int\u00e9rieur des cellules.<\/p>\n Combiner les m\u00e9thodes<\/strong><\/p>\n Pour r\u00e9soudre ce probl\u00e8me, le physicien allemand Winfried Denk a d\u00e9velopp\u00e9 dans les ann\u00e9es 1990 une autre m\u00e9thode qui permet d\u2019obtenir des informations microscopiques des couches profondes des tissus: la microscopie \u00e0 deux photons, devenue une technique de routine pour de nombreux chercheurs.<\/p>\n Au lieu de fournir l\u2019\u00e9nergie requise \u00e0 l\u2019excitation des mol\u00e9cules fluorescentes par un seul photon, sa technique utilise deux photons qui poss\u00e8dent chacun la moiti\u00e9 de l\u2019\u00e9nergie n\u00e9cessaire. L\u2019un des avantages est que cette lumi\u00e8re a une longueur d\u2019onde plus \u00e9lev\u00e9e, ce qui lui permet de p\u00e9n\u00e9trer plus profond\u00e9ment dans les tissus.<\/p>\n \u00abOn ne d\u00e9passe pas la limite de diffraction, mais on obtient des informations sur un millim\u00e8tre de profondeur\u00bb, souligne Thomas Misgeld. Avec ses collaborateurs, il a montr\u00e9 \u00e0 l\u2019aide du microscope \u00e0 deux photons que certains nerfs peuvent survivre \u00e0 une l\u00e9sion si l\u2019on arrive \u00e0 annuler un afflux trop important de calcium dans la demi-heure suivant la blessure. Valentin N\u00e4gerl utilise \u00e9galement la technique \u00e0 deux photons. Il l\u2019a combin\u00e9e au principe STED afin d\u2019obtenir des images de tissus profonds en super-r\u00e9solution.<\/p>\n \u00abL\u2019id\u00e9e de s\u00e9parer les d\u00e9tails d\u2019objets tr\u00e8s proches en passant par des excitations diff\u00e9rentes des mol\u00e9cules fluorescentes offre encore de grandes opportunit\u00e9s aux chercheurs\u00bb, souligne Stefan Hell. Ces bricoleurs de la microscopie combinent diff\u00e9rentes m\u00e9thodes et utilisent de nouveaux proc\u00e9d\u00e9s d\u2019activation et de d\u00e9sactivation mol\u00e9culaire pour obtenir des images encore plus pr\u00e9cises et rapides. Stefan Hell est convaincu qu\u2019il n\u2019existe en principe aucune limite \u00e0 la nettet\u00e9 des d\u00e9tails, et r\u00eave de les utiliser pour un jour voir directement la structure m\u00eame des mol\u00e9cules. STORM <\/strong> SIM <\/strong> 2 photons <\/strong> Confocal <\/strong> Une version de cet article est parue dans le magazine Technologist (no 2 \/ 2014).<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":" Le prix Nobel de chimie 2014 c\u00e9l\u00e8bre la microscopie de super-r\u00e9solution, qui permet de s\u2019affranchir des limites de l\u2019optique. Elle est devenue un outil essentiel aux sciences du vivant.<\/p>\n","protected":false},"author":20168,"featured_media":0,"comment_status":"open","ping_status":"closed","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"footnotes":""},"categories":[7],"tags":[],"class_list":["post-4264","post","type-post","status-publish","format-standard","hentry","category-technophile","technophile"],"aioseo_notices":[],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/largeur.com\/index.php?rest_route=\/wp\/v2\/posts\/4264","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/largeur.com\/index.php?rest_route=\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/largeur.com\/index.php?rest_route=\/wp\/v2\/types\/post"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/largeur.com\/index.php?rest_route=\/wp\/v2\/users\/20168"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/largeur.com\/index.php?rest_route=%2Fwp%2Fv2%2Fcomments&post=4264"}],"version-history":[{"count":0,"href":"https:\/\/largeur.com\/index.php?rest_route=\/wp\/v2\/posts\/4264\/revisions"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/largeur.com\/index.php?rest_route=%2Fwp%2Fv2%2Fmedia&parent=4264"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/largeur.com\/index.php?rest_route=%2Fwp%2Fv2%2Fcategories&post=4264"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/largeur.com\/index.php?rest_route=%2Fwp%2Fv2%2Ftags&post=4264"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}
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\nQuatre techniques qui ont r\u00e9volutionn\u00e9 la microscopie <\/strong><\/p>\n
\nDes marqueurs fluorescents sp\u00e9cifiques sont d\u2019abord activ\u00e9s de mani\u00e8re al\u00e9atoire par la lumi\u00e8re, de sorte que seules quelques mol\u00e9cules isol\u00e9es de l\u2019\u00e9chantillon contribuent \u00e0 l\u2019image, qui se construit petit \u00e0 petit.<\/p>\n
\nLa r\u00e9solution de l\u2019image est augment\u00e9e par l\u2019utilisation d\u2019un \u00e9clairage constitu\u00e9 de motifs r\u00e9p\u00e9titifs qui cr\u00e9ent des interf\u00e9rences de Moir\u00e9 avec le plan focal.<\/p>\n
\nL\u2019excitation fluorescente se fait par deux photons ayant chacun la moiti\u00e9 de l\u2019\u00e9nergie n\u00e9cessaire. Ils peuvent p\u00e9n\u00e9trer plus profond\u00e9ment dans les tissus, mais ne permettent pas d\u2019aller au-del\u00e0 de la limite de diffraction.<\/p>\n
\nUne lumi\u00e8re focalis\u00e9e en un point \u00e9claire un objet et passe par un petit trou qui bloque la lumi\u00e8re ne provenant pas du point focal. Cela augmente consid\u00e9rablement le contraste mais ne permet pas de franchir la limite de diffraction.
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